C反應(yīng)蛋白診斷試劑

實驗原理
包被板上包被有抗CRP抗體，與稀釋標準品和樣本一起孵育，孵育中，CRP特異性結(jié)合包被抗體，洗板除去未結(jié)合的血清蛋白，抗原-抗體混合物與過氧化物酶酶聯(lián)物抗體反應(yīng)，洗滌除去為結(jié)合酶聯(lián)物，加入含有TMB和過氧化氫的著色液孵育，與微孔板結(jié)合的免疫復(fù)合物的量與顏色強度成正比，加0.5M硫酸終止反應(yīng)，450nm處檢測吸光值
以標準品濃度和OD值做標準曲線，樣本CRP濃度可直接從標準曲線上得出
此試劑盒在美國僅用于科研
試劑盒組成

1、包被板，96孔，包被有抗人CRP單克隆抗體

2、標準品，5瓶，0.2ml，含1/10的預(yù)稀釋標準品，濃度為：0；0.4；1；5；10ug/ml

3、酶聯(lián)物，1瓶，12ml，含過氧化物標記的抗人CRP單抗；抗菌劑和惰性紅色染料

4、樣本稀釋液，1瓶，40ml，5X濃縮，含0.09%NaN 3和抗菌劑，惰性綠色染料

5、洗滌液，1瓶，50ml，20X濃縮，含磷酸緩沖洗滌液

6、底物液，1瓶，15ml，含過氧化氫和TMB

7、終止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸 
實驗所需材料但試劑盒未提供

1、精確移液器和槍頭

2、標準容積的潔凈玻璃器皿

3、樣本稀釋用的潔凈玻璃試管

4、酶標儀(450nm) 
貯存條件
2-8℃

1、將微孔板條貯存于原裝含干燥劑的密封袋內(nèi)，直至全部用完

2、不要使用過期的試劑
樣本采集與準備
此實驗可用到血清和血漿
采樣后立即分離出血清，避免使用溶血，脂血或黃疸血，可能回導致錯誤結(jié)果
將血清轉(zhuǎn)移干凈試管
樣本可在2-8℃下貯存幾天，或凍存更長時間，避免反復(fù)凍融
一般注意事項
1使用一次性加樣槍頭加樣，避免交叉污染．
2實驗前，將所有試劑平衡至室溫．試劑混勻時避免產(chǎn)生氣泡．
3一旦實驗開始，所有實驗步驟應(yīng)中斷進行
4吸光值是孵育時間和溫度的一條函數(shù)．所以應(yīng)控制好實驗加樣，建議每次只做20份樣品和一組標準品，作雙份檢測． 
試劑準備
洗滌液：用去離子水稀釋50ml的洗滌濃縮液至總體積為1000ml，稀釋洗滌液可在2-8℃下至少放置1個月
過高溫度可能回引起濃縮洗滌液出現(xiàn)渾濁，其并不會有影響，稀釋后就會變澄清 
樣本稀釋液：用去離子水稀釋40ml的樣本稀釋濃縮液至總體積為200ml，2-8℃下可放置3個月或更長時間，始終保持澄清
 
實驗步驟

1、10倍預(yù)稀釋標準品血清按如下方法進行1:100稀釋：

10ul的標準品至稀釋試管內(nèi)，加990ul的已稀釋的樣本稀釋液，混合

2、樣本按1:1000分兩步進行稀釋：10ul的樣本血清與990ul的已稀釋的樣本稀釋液，混合；加450ul的已稀釋的樣本稀釋液與50ul的100X的預(yù)稀釋樣本，混合(注意：稀釋樣本貯存不要超過8小時)

3、將100ul的稀釋標準品和樣本加入相應(yīng)微孔內(nèi)

4、室溫下蓋板孵育30±2min

5、洗滌緩沖液洗板3次

可選用合適的自動洗板機洗板，或手動洗板：迅速倒到孔內(nèi)反應(yīng)液，再注入稀釋洗滌液．第三次洗板時，讓稀釋洗滌液在微孔內(nèi)停留2－3分鐘．每次洗板都要換新的稀釋洗滌液．zui后倒掉所有溶液并在吸水紙上拍干，去除殘留液滴．

1、每孔加100ul的酶聯(lián)物，蓋板室溫下孵育30±2min

2、重復(fù)步驟5）洗板

3、每孔加100ul的底物液

4、避光，室溫下孵育10±2min

5、每孔加50ul的終止液

6、加入終止液后，30min內(nèi)450nm處酶標儀上讀數(shù)

 
結(jié)果分析與說明
以標準品的吸光度均值與相應(yīng)的濃度建立*標準曲線．
患者樣品的濃度通過測的吸光值直接從標準曲線計算出濃度．
根據(jù)經(jīng)驗或可利用的計算機方法，也可用其它數(shù)據(jù)簡化分析．
zui低檢測濃度
zui低檢測濃度約為0.02 μg/ml.

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